基本培養(yǎng)條件:

培養(yǎng)基：90％DMEM +10％胎牛血清

溫度：         37℃

         氣相：95％空氣，5%二氧化碳

2.細胞運輸：

本細胞為貼壁細胞，常規(guī)運輸方式是將細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿新鮮的培養(yǎng)液并封好瓶口進行運輸。

根據(jù)氣溫的高低及運輸距離的遠近，我們可能采取以下兩種方式運輸。

活細胞YM消化離心后血清發(fā)貨；

凍存管發(fā)貨。

3.客戶收到細胞后請嚴格按照以下要求進行操作。

3.1培養(yǎng)前的注意事項：
A. 細胞出庫前都是生長良好,我們會對出庫細胞進行拍照留檔(建議用戶在收到細胞時拍照片,細胞拍照時請用100X 、200X倍數(shù)各拍上2~3張照片留存,可用作細胞狀態(tài)的對比,拍攝的照片應當清晰)。

B. 用戶在收到細胞后,先觀察培養(yǎng)瓶是否完好,培養(yǎng)液是否外滲,培養(yǎng)液是否渾濁。

3.2新購細胞的初步培養(yǎng)：

客戶收到細胞后在未開封前,先用75％酒精將培養(yǎng)瓶外表擦拭干凈,鏡檢細胞貼壁情況。將細胞置于培養(yǎng)箱中進行1-2小時的緩沖，待細胞恢復基本生長狀態(tài)后，進行后續(xù)細胞實驗。

細胞恢復基本生長狀態(tài)后，倒置顯微鏡下觀察整個細胞生長情況：

A. 細胞密度未達85％時，用75％酒精噴灑培養(yǎng)瓶后放在生物操作臺內(nèi)，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶，吸取剩余培養(yǎng)液，只留6~8ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

B.細胞長滿（達85-95％），即可進行傳代。

3.3細胞培養(yǎng)：

A.細胞密度未達85％時，5~8ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

B.培養(yǎng)基營養(yǎng)耗盡時，需及時換新鮮培養(yǎng)基；

C.細胞長滿（達85-95％），即可進行傳代。

傳代參考步驟如下：

a.棄去培養(yǎng)液，用無鈣鎂D-PBS洗滌1-2次

對于T25培養(yǎng)瓶來說，加入2-3ml 0.25%的YM-EDTA消化液，置b.37℃消化，并不時用顯微鏡觀察細胞消化情況，如細胞回鎖變圓、透亮、輕拍瓶壁呈流沙樣脫落，則迅速回操作臺，加入6-8ml含10％血清的培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細胞，使其變成單細胞懸液。

將細胞收集于離心管中以c. 80g-120g離心力離心2-5min，棄上清 , 輕彈管底 , 將細胞混懸于殘留上清中。

d.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，進行傳代、凍存；

e.如果沒有特別說明，收到的細胞第一次傳代比例為1:2，后期可按1：4-1：6的比例傳代。

3.4細胞觀察：

A、觀察細胞密度做好用（4X物鏡）低倍鏡觀察，以便正確的判斷細胞密度細胞。

B、觀察細胞形態(tài)請用（10X或20X）高倍鏡觀察。

3.5細胞保存：

凍存配方：70％基礎培養(yǎng)液+20％胎牛血清+10％DMSO

保存條件：液氮保存

3.6注意事項：

A、瓶中運輸?shù)呐囵B(yǎng)液我們建議保留培養(yǎng)一代后，傳代后分別用客戶自己的培養(yǎng)基和運輸培養(yǎng)基分別培養(yǎng)一瓶。以防止細胞不適應客戶自用的培養(yǎng)基而造成狀態(tài)不好或細胞死亡。

B、如發(fā)現(xiàn)細胞貼壁不牢，有少量脫落，可離心運輸用培養(yǎng)基，將細胞離心下來，混懸后接種到原瓶內(nèi)；